制備型加壓液相色譜,按照色譜柱和樣品量的大小,分為:(1)低壓液相色譜;(2)中壓液相色譜;(3)高壓液相色譜;(4)快速色譜。低壓、中壓與高壓液相色譜的壓力范圍之間會存在一定交疊,沒有統一、明確的標準。
1.快速色譜
柱壓通常為2bar(或30psi)左右,對于那些容易分離的簡單混合物,由于快速色譜具有操作簡便、經濟等優點,常常是實驗室的。但快速色譜不同于一般的層析分離,這種分離沒有壓力,而快速分離通常使用瓶裝氮氣加壓,使流動相具有一定的流速,從而縮短了分離時間。
快速色譜使用的柱子一般是玻璃柱,柱直徑為3~10cm.長度為7~15cm。快速色譜中使用zui廣泛的固定相為硅膠。采用的粒徑通常為:25~40μm,40~63μm或63~200μm的球形固定相。其它如鍵合相、氧化鋁、聚酰胺吸附劑也常用作快速色譜的固定相使用。
2.低壓色譜(LPLC)
柱壓一般低于5bar(或75psi)。
低壓色譜一般是由蠕動泵、進樣閥和檢測器組成,可以連續化,實現自動的梯度淋洗和餾分收集等操作。色譜柱管一般是玻璃或聚合物材料的,長度一般為240-440mm,內徑為10-40mm。
對于大多數在紫外區有吸收的物質,光學檢測器很常用。填料一般使用軟質的葡聚糖、瓊脂糖、纖維素、合成高聚物或離子交換劑,粒徑一般為40-60μm。
3.中壓液相色譜(MPLC)
柱壓在5-20bar(或75-300psi)之間,廣泛用于實驗室和工業規模的生物制品(如動物臟器提取液、濃縮液、體液、植物提取液、生物技術發酵液等--往往需要經過濾膜作初級凈化)的處理,以提取或純化所需的產品。
中壓液相制備色譜的主要部件為輸液泵、進樣閥、檢測器、餾分收集器等,早期的中壓液相制備色譜,其輸液泵zui大流速可達156mL/min,并配有阻尼器,以保證液流的穩定;進樣器配有0.5-50mL的不同體積的定量管;檢測器有紫外和示差折光檢測器,流通池體積比較大,允許大流量流動相通過而無需分流;餾分收集器有原盤式和排式兩種,原盤式的接收管zui多達80個,而后者則更多;色譜柱內徑9-105mm,長度250-1760mm不等。
對于一般中壓制備色譜,當色譜柱直徑較大時,柱頭往往設計成錐形或有類似于傘狀的液流導向結構,使得當大量樣品進入到柱頭上時,能迅速地分散到整個柱橫截面上,及時被流動相沖走,避免了因樣品的局部過濃而引起柱超負荷和譜帶加寬。柱子填料則采用比較耐壓的交聯改性的多糖凝膠(如Sepharose CL,Superose等),聚合物微球,復合材料介質或硬質SiO2基體的化學鍵合相等,粒徑一般在25~40μm(zui常用的填料尺寸是15-25μm,25-40μm或40-63μm),可采用濕法或干法裝柱。
4.高壓液相色譜(HPLC)
是指柱壓一般大于20bar(或300psi)的“高壓(或)液相色譜”,通常指所用色譜柱的塔板數大于2000,一般是在2,000~20,000的范圍之間。
當需要從大量的物質中分離純化不足1%的所需成分時,分離工作將會十分困難,往往在純化的zui后階段需要使用10μm或更小顆粒的填料。為獲得所需微量組分,可采用如下分離手段:制備型分離→半制備型分離→分析型分離→產物。為提高每次分離獲得純品的數量,制備型高壓液相色譜分離通常在超載情況下運行。
高壓液相色譜,即目前常用的液相色譜。色譜柱內填裝的是粒度范圍較窄的微小顆粒固定相(3~30μm),為使流動相流出,需采用較高的壓力,同時系統的復雜性及成本亦增大,但分辨率可得到較大的提高。而填裝較大顆粒的固定相時,如中壓液相色譜系統,裝柱較容易,柱的通透性較高(只需較低的泵壓力),可采用更大的色譜柱和更經濟的儀器,由此分辨率也較低。
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用分析型高壓液相色譜進行制備型分離
當所需純化合物的量很少時(微克級至幾毫克),可用分析型色譜柱進行多次分離。效果和利用大直徑色譜柱進行一次性分離相同。采用小直徑色譜柱時,可利用已有的分析型儀器,而無需在色譜柱、填料及附件方面投入更大資金;另外,還可在很大程度上避免由于放大所產生的問題,使分離速度加快。
小直徑色譜柱的尺寸一般為250×4.6mm,通常裝有反相填料,每次可進樣5~100ug,通過多次進樣分離,可獲得足夠的純品。例如,Suzuki等(1994)報道從豆科植物羽扇豆(Lupinus Hirsutus)中分離一羽扇豆生物堿糖苷時,其zui后的分離步驟采用LiChrosorb Si60,5μm,250×4.6mm色譜柱進行高壓液相色譜分離,洗脫劑為含25%甲醇的yi醚溶液-5%氨水50:1。
經常需用分析型色譜柱進行分離的一個領域是對肽類化合物的純化。生物活性肽的含量通常很低,用分析型高壓液相色譜作為zui后的純化手段時,不會使色譜柱超載。
為了提高分離效率,可將分析型高壓液相色譜柱連接起來使用。此時可采用顆粒度在20~30μm的填料,以保持適當的通透性,尤其是當使用含水溶劑時。當使用己烷等有機溶劑時,由于流動相的粘度較低,可使用顆粒度為10μm的填料。
然而由于分析型色譜系統無法提供大規模制備型分離所需的流速,其應用受到一定限制。